非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范

本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲猪瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。

1.  主要试剂

1.1  核酸提取试剂盒。

1.2  无核酸酶水。

1.3  荧光PCR预混液（2×）。

1.4  引物和探针：P72、CD2v、MGF360-505R基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供（联系人：李林，电话：0532-87839188）。 

1.5 阳性和阴性对照：阳性对照样品为ASFV基因组DNA标准物质（用无核酸酶水稀释1000倍后使用），由国家非洲猪瘟参考实验室提供；阴性对照样品为无核酸酶水。

2.  主要仪器设备

2.1 荧光PCR扩增仪。

2.2 台式低温高速离心机。

2.3 组织匀浆机。

2.4 微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格）。

2.5 无核酸酶离心管与吸头。

2.6  PCR扩增管。

3.  样品采集和运输保存

    对活猪，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；对病死猪或已屠宰猪，可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。

    样品的运送与保存应满足NY/T 541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》相关要求。上述样品可在4°C最长保存2天；如需长时间保存，应置于-20°C以下。

4.  样品处理

4.1  组织样品

    取0.1 g～0.2 g样品，加入1 mL～2 mL预冷的PBS（pH 7.4），用组织匀浆机高速匀浆，制成10%组织匀浆液，以5000 r/min离心10 min，取200 μL上清液进行核酸提取。

4.2  液体样品

抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理，直接取200 μL进行核酸提取。

5.  病毒核酸的提取和纯化

    取已进行前处理的样品200 μL，可按传统方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20°C以下冷冻保存。每次抽提核酸，应包括一个阳性对照样品和一个阴性对照样品。

6.  荧光PCR检测

6.1  荧光PCR反应液制备

    在灭菌的离心管中制备符合检测样品数量（包括阳性、阴性对照）要求的荧光PCR反应混合液，至少额外制备两个样品的量。每个样品配制20 µL PCR反应混合液，组成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探针预混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探针分别用FAM、VIC和Cy5进行标记）、12.5 mL 2×探针法荧光PCR预混液。

    分别取20 µL PCR反应混合液加至每个PCR扩增管中；再分别取5 µL DNA模板加入到PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板。加入模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在荧光PCR仪中。按下述条件运行扩增程序。

6.2  荧光PCR扩增条件

    50°C孵育2min；95°C预变性5min；95°C变性15s，60°C退火延伸1min，45个循环，在每一循环的60°C时收集FAM、VIC和Cy5通道中的荧光信号。

6.3  结果分析

    Ct值由荧光PCR仪的软件自动确定。

6.3.1  试验成立条件

    阳性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均＜35且出现特异性扩增曲线，阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因无Ct值或阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值≥40且无特异性扩增曲线，判为试验有效。试验无效时应重新进行试验。

6.3.2  P72、CD2v、MGF 360-505R基因检测结果判定

6.3.2.1  P72基因检测结果判定（FAM通道）

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV P72基因检测阳性；无Ct值或Ct值≥40，判为ASFV P72基因检测阴性；38＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值＜40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV P72基因检测阳性，否则判为ASFV P72基因检测阴性。

6.3.2.2  CD2v基因检测结果判定（VIC通道）

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV CD2v基因检测阳性；无Ct值或Ct值≥40，判为ASFV CD2v基因检测阴性；38＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值＜40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV CD2v基因检测阳性，否则判为ASFV CD2v基因检测阴性。

6.3.2.3  MGF 360-505R基因检测结果判定（Cy5通道）

    被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性；无Ct值或Ct值≥40，判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性；当38＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值＜40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性，否则判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性。

6.3.3  综合判定

结合P72、CD2v、MGF 360-505R等3个基因的检测结果进行综合判定。具体判定标准见附表。

附表   综合判定标准

注：“+”代表检测阳性；“-”代表检测阴性