副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS) 引起猪的多发性浆膜炎和关节炎,该病又称为猪革拉斯氏病(Glasser’s disease)。近年来,副猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为危害世界养猪业的重要疾病[1]。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪,主要在断奶后和保育阶段发病,通常见于5-8周龄的猪,发病率一般在10%-15%,严重时死亡率可达50%[2]。随着我国规模化、集约化猪场的发展,副猪嗜血杆菌已在我国出现流行趋势,许多地区都有该病发生的报道 [3,4]。笔者对潍坊地区1个猪场疑似猪格拉泽氏病的病例进行了病原的分离鉴定和药敏试验,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料:在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织等。
1.1.2 培养基:巧克力琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)。
1.1.3 生化试验试剂:氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等,均购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.4 药敏试纸:头孢菌素、丁胺卡那霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素, 均购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病理变化观察
剖检发病仔猪,观察肺等组织的病理变化。
1.2.2 触片镜检
肺组织、心血、胸水和腹水触片,镜检。
1.2.3 细菌分离培养
无菌取肺病变组织、心血、腹膜和胸水划线接种巧克力琼脂平板和TSA平板。置37℃培养48h。观察结果。后挑取单个菌落,再进行纯培养。
1.2.4 生化试验
挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中,同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)5μl,置于37℃5%的CO2 培养箱培养48h,观察结果。
1.2.5 药敏试验
将TSA纯培养物,吸取0.2mL均匀的涂布在TSA平板上,再把药敏试纸贴在TSA平板上,置37℃5%的CO2培养箱中培养48h,测量抑菌环直径并判定结果。
2 结果
2.1 剖检变化观察
剖检病死猪,发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物;肺脏呈纤维素性胸膜肺炎, 肺臌胀, 暗紫红色,表面覆有纤维素性渗出物;支气管内有淡红色泡沫样渗出物;心包积液;腹腔内有大量透明黄褐色渗出液, 有的呈胶胨状凝块;全身淋巴结肿大,暗红色。
2.2 触片镜检
取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片,革兰氏染色,镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌,个别两极球杆状革兰氏阴性菌。
2.3细菌的分离培养
无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小小菌落,镜检可见大小不一、形态有细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。接种无NAD的TSA不生长。
2.4生化鉴定
挑取细菌分别接种于生化鉴定管中,生化试验结果如下。

项目

氧化酶

甘露醇

吲哚

葡萄糖

半乳糖

果糖

蔗糖

核糖

脲酶

伯胶糖

结果

+

+

+

+


注:“-” 阴性;“+” 阳性
2.5 药敏试验
 将纯化培养的细菌接种于鲜血琼脂平皿, 用纸片法进行药敏试验,37℃培养24 h观察。结果该菌对头孢菌素、丁胺卡那霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻肟高敏,对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。
3 讨论
3.1 通过对该猪场流行病学调查,临床上可初步诊断该病由副猪嗜血杆菌引起。为了鉴定该菌,在试验室进行了分离菌的形态特征观察、培养特性和生长特性观察、生化反应等方面的实验,进一步确诊为副猪嗜血杆菌。通过药敏试验也为下一步副猪嗜血杆菌病的治疗提供了依据。
3.2 副猪嗜血杆菌在病料中的分离率比较低,一般患病猪死亡12小时后,在病料中几乎分离不到,因此需在患猪剖杀或死亡12小时内及时进行病原分离。而且副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻,其在巧克力培养基上培养48h生长也较差。一般该菌的分离应采用含NAD、酵母浸出液和10%马血清的TSA培养基。此外,目前各猪场在实际生产中广泛使用抗生素,也是副猪嗜血杆菌分离率比较低的原因之一。

参考文献

原创文章,作者:王光振,如若转载,请注明出处:http://zgdwbj.com/archives/9707

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