一起蛋鸡腺病毒感染的诊断及对SPF鸡的致病性

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FAV) 属于腺病毒科禽腺病毒属，分为I 、II 和III 3个群， 其中I 群禽腺病毒(FowlAdenovirus Group I, FAV-I)具有共同的群抗原，依据其分子结构特征分为5个群(A—E)、12个血清型^[1-2]。FAV急性感染主要表现为包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等症状^[3]。该病多发于肉鸡、肉杂鸡，近期也开始感染产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率还比较高。2018年11月山东某蛋鸡场发生的疑似禽腺病毒感染鸡群，临床表现为心脏包膜中有淡黄色液体，肝脏表面有出血点，经实验室病毒分离与鉴定为血清4型禽腺病毒感染。分离到的病毒对SPF鸡的临床致死率很高，表现症状典型。

1 材料与方法

1.1 病料信息

病料来源于山东省某蛋鸡场，80日龄海兰蛋鸡，剖检疑似禽腺病毒感染，无菌采集具有典型病变的肝、脾、肾等组织用于病毒分离。

1.2试验材料

SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，由国药集团扬州威克生物工程有限公司实验室孵化及饲养。

DNA提取纯化试剂盒购自上海凯杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通琼脂糖凝胶购自北京全式金生物技术有限公司， DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，根据GenBank中I群禽腺病毒的Hexom基因序列保守区，设计合成引物，F：5’一AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG一3’；R：5’一TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC一3’ ,引物由华大基因公司合成，其他试剂均为国产试剂。

1.3病毒分离

采集病死鸡肝、脾、肾等病变组织，按1:5加入含适当浓度抗生素的灭菌8.5％生理盐水，充分研磨，反复冻融3次后，离心取上清^[4]，经0．22 μm微孔滤膜过滤除菌，卵黄囊接种5个7日胚龄的SPF鸡胚，置37℃温箱孵育。每l2h照胚1次，将24h内死亡鸡胚弃去，24h后死亡鸡胚收取尿囊液并观察胚体是否病变， 7d后存活的鸡胚，置4℃冻死，收取尿囊液并观察胚体是否病变。

1.4血凝试验

取30μL收集的尿囊液用生理盐水在血凝板中先进行倍比稀释2¹¹，随后每孔加入30μL 1％鸡红细胞；置37℃反应10 min。若样品孔出现鸡红细胞凝集现象，则判定为有血凝性；反之则为血凝阴性。

1.5 PCR检测

用DNA提取试剂盒抽提鸡胚尿囊液中的DNA，置-20℃备用。以提取的病毒DNA作为模板进行PCR扩增。反应体系为：DNA模板2μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5μL，ddH₂O 8.5μL，上游引物和下游引物各lμL。反应程序为：95℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸lmin，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经l％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳处理后，置于凝胶成像系统中拍照鉴定，阳性样品送南京金斯瑞物科技有限公司进行序列测定 ，并将测定序列与GenBank上已发表FAdV核苷酸序列进行同源性比对。

1.6对SPF鸡的致病性试验

2周龄SPF鸡以0.3mL／只的剂量胸肌接种该分离病毒，每日观察鸡只精神状况、采食量、发病情况，记录死亡时间，计算死亡率，死亡鸡只剖检记录眼观病变，连续观察10d。

1.6.1发病SPF鸡病理组织学检测

取病死鸡的肝脏等组织用福尔马林固定，按文献方法^[5]制作石蜡切片，苏木精-伊红染色，染色后进行组织病理学诊断。

2 结果

2.1病鸡剖检症状

对现场病死鸡进行剖检发现，主要表现为包心，内含黄色积液（见图1A)，肝脏表面有大量出血点（见图1B）。

A包心，内含黄色积液                  B肝脏表面有大量出血点

图1.病死鸡组织病变

2.2病毒分离

SPF鸡胚在接种病料后，144h内全部死亡，血凝试验结果表明收获的尿囊液没有血凝性，排除了流感和新城疫病毒的感染的可能。接种病料死亡的鸡胚出现明显的病变，主要表现为胚体出血，肝脏呈黄色，有明显的出血点(见图2)。

A.病变鸡胚  B.正常鸡胚

图2接种鸡胚病变

2.3 PCR鉴定和序列分析

PCR产物经l％琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出的目的条带与预期设定的腺病毒阳性对照的条带相符，大小约为500bp（见图3）。测序结果表明，此病毒分离株的基因序列与Genbank已发表4型FAdV序列同源性达99％，从而确定为血清4型FAdV。

3     2     1    M

注：M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2腺病毒阳性对照；3.病毒DNA的PCR扩增产物.

图3 PCR鉴定结果

2.4对SPF鸡的致病性试验结果

SPF鸡攻毒后，前3d没有明显症状，第4d开始出现采食量下降，精神沉郁，144 h内全部死亡，剖检主要表现为包心，内有淡黄色清亮液体(见图4A)；肝脏发黄、表面有散在出血点(见图4B),肾脏肿大(见图4C)。

A包心，内有淡黄色清亮液体              B肝脏发黄、表面有散在出血点

C肾脏肿大

2.4.1发病SPF组织病理学检测

组织病理学显示:肝细胞内可见嗜碱性包涵体(见图4A、图4B)。

A肝细胞内嗜碱性包涵体               B肝细胞内嗜碱性包涵体

图4肝脏病理变化

3.讨论

I群禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV—I)广泛存在于多种禽类的消化道和呼吸道中，一般不表现临床症状，但在一定条件下作为继发病原引起鸡群发病和死亡^[6]。2014—2016 年该病在我国发病范围广泛，给养禽业造成了巨大损失^[2]。FAdV-I 主要侵害3-8 周龄的肉鸡、蛋鸡青年鸡、黄鸡及麻鸡，病死率最高可达80%，临床主要表现为心包积水综合征(HPS)和包涵体肝炎(IBH)。FAdV 既可通过种蛋垂直传播又可通过病鸡水平传播，但以垂直传播为主^[7]。I群禽腺病毒分12个血清型，其中在蛋鸡、蛋种鸡上4型和8b型禽腺病毒流行最为广泛，4型主要表现为心包积水综合征，而8b型则主要表现为包涵体肝炎^[8]。临床病例显示，一些免疫抑制病如传染性法氏囊病（IBDV）和传染性贫血病（CAV）等混合感染是禽腺病毒感染后发病率和死亡率加剧的一个重要因素^[9]。

本试验从山东省某蛋鸡场采集病料，根据临床解剖病变，病毒分离、血凝试验、PCR扩增及其产物序列分析，最终确诊该病例为禽4型腺病毒感染，本试验通过用分离的毒株对SPF雏鸡进行攻毒试验，致死率达到100％ ，且均能发生与自然感染的剖检病鸡一致的病理变化，均可见肝脏发黄，有散在的出血点，心包内有淡黄色清亮液体，肾脏肿大。表明该分离的FAdV一4毒株具有很强的致病性。

针对此种腺病毒感染一方面疫苗预防是有效的方法，另一方面加强养禽场生物安全是预防和控制该病发生的关键。I群禽腺病毒的l2个血清型交叉保护性较差，因此在防控上必须选用与流行株匹配的疫苗株和卵黄抗体才能有效遏制疫情的蔓延^[10]。一旦鸡群发病无特效药物，可通过做好鸡舍卫生消毒工作，防止病毒的水平感染，补充充微量元素和维生素及鱼肝油等以增强体质提高抗病能力，同时添加适量抗生素防止继发感染。死亡率逐渐增大的鸡群可以紧急注射特异性高免血清或卵黄抗体。因本病目前无明确的致病机理，建议使用疫苗进行防控，选择合适血清型灭活疫苗给健康鸡群进行免疫预防，能达到95% 以上的保护效果。其中在蛋鸡上，7-10 日龄和40日龄左右进行灭活疫苗的接种，可很好控制本病的发生。该鸡场发病后选择紧急注射腺病毒卵黄抗体并适当添加抗生素进行治疗，加强鸡舍通风消毒，死亡率下降显著，1周后鸡群稳定，几乎未见死亡病鸡,鸡群恢复健康后再选择灭活疫苗进行接种。本试验诊断为该鸡场下一步饲养的预防和治疗工作起到一定参考作用。