猪细小病毒（Parcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，其流行面广，猪场感染严重，给养猪业带来巨大的经济损失。我国常以接种疫苗为主的综合性防制措施控制该病的流行，因此制备优质安全的疫苗对防制该病具有重要意义。目前，在制备疫苗时，为了确保或提高疫苗的效价，常常采用增加抗原量的方法来达到这一目的。为此，我们选用医药工业中广泛使用的膜分离技术，即通过超滤的方法浓缩病毒。在研制猪细小病毒灭活疫苗时，为了减少接种剂量，又要充分保证疫苗的抗原含量，使用了超滤装置进行含毒细胞培养液的浓缩。通过浓缩前、后，含毒细胞培养液的血凝活性测定，病毒含量测定，充分证明，获取的浓缩含毒细胞培养液明显提高了抗原含量，增加了疫苗的免疫效果，现将有关情况介绍如下。
1 材料与方法
1.1 PPV毒株 自行分离、鉴定和保管的PPV L株，毒价为≥107TCID50/0.2mL。1.2 ST传代细胞 购自中国兽医药品监察所60代细胞。1.3 试剂与器材 MEM(GIBCO)、新生犊牛血清（济南劲牛生物公司）、胰蛋白酶-EDTA细胞分散液、7.5%NaHCO3、0.4mol/L NaOH、pH7.2 PBS、青霉素、链霉素。 96孔微量血凝板（U型）、96孔细胞培养板（BIOFIC）、CO2培养箱（SANYO）、振荡器、离心机等。1.4 超滤系统 UltrareservoirTM 5L，滤膜类型为36062303 GR，滤过分子极限为50000Da，PALL股份有限公司生产。1.5 PPV含毒细胞培养液的制备 取经传代培养24h的ST传代细胞系培养物（40%～60%贴壁伸展），按0.5%接毒，置37℃旋转培养，每日观察细胞病变情况。当细胞病变达到70%时，经冻融3次，收获含毒细胞培养液，置-20℃冰箱冻结保存备用。1.6 血凝价（HA）测定 按照“红细胞凝集试验法”进行。在96孔微量血凝板（U型）上，以pH7.2 PBS作稀释液，将待测的含毒细胞培养液作2倍连续稀释，加入0.6%豚鼠红细胞悬液，置室温1h，当红细胞对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时，判定结果。1.7 TCID50测定 以MEM培养液将猪细小病毒作连续10倍稀释，即10-1、10-2……每个稀释度取20μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST细胞悬液，每孔100μL（细胞含量以3×105个/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照。置5%CO2培养箱中37℃培养。逐日观察细胞病变和对照，共观察2d～4d，并记录细胞病变孔数。按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。1.8 超滤系统与滤膜的预处理 用0.4mol/L NaOH溶液注满贮液缸、滤膜及管道，过夜。以灭菌去离子水彻底冲洗滤缸、滤膜及管道，用pH试纸测定冲洗液，当pH达到7.0时，冲洗完毕。再用预计浓缩量的1倍～2倍的pH7.2 MEM溶液，冲洗进料和回液通路，滤膜的最低处理时间为5min～10min，过膜压力控制在20psig左右。1.9 超滤系统和滤膜使用后的冲洗 以滤出液0.5L~1.0L冲洗滤出端。用滤出液冲洗膜的表面，循环10min~15min。再用去离子水冲洗。然后将0.4mol/L NaOH溶液注入整个滤膜系统，反复循环清洗2h~3h，使滤膜在NaOH溶液中过夜。经滤膜恢复率测定达75%以上时，将滤膜贮存于0.4mol/L NaOH溶液中，在室温条件下（20℃~25℃）放置即可。
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本文全文刊于本杂志2012年12月刊，可从知网下载或向本刊订阅。
原创文章，作者：刘 少娟，如若转载，请注明出处：http://zgdwbj.com/archives/10626
