柴胡注射液化学成分分析与质量标准探讨

柴胡注射液收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十七册,具有清热解表之功效,用于治疗感冒、流行性感冒及疟疾等的发热[1]。柴胡注射液为常用中药注射剂之一,1941年研制成功,首开中药注射剂之先河,至今已有七十年的历史[2]。由于柴胡注射液为柴胡药材的水蒸气蒸馏液,主要含挥发性成分,其质量标准建立非常困难,至今没有确切的指标控制其质量,而使其产品的稳定性和均一性难以保证。现行质量标准尽管有〔鉴别〕和〔检查〕项,但均无专属性,特别是〔检查〕项下的吸光度测定,根据我们的研究结果发现,其不仅没有达到控制质量的目的,而且有可能带来负面作用。因此,为了建立柴胡注射液有效的质量控制方法,为药品标准的提高和修订提供科学依据,我们模拟柴胡注射液的现行标准制备工艺和目前企业常用的加酸、加盐反复蒸馏的生产工艺制备相应的样品,对其化学成分和紫外吸收的相关性进行了系统分析,明确了其产生紫外吸收的主要成分,并阐明了加酸、加盐工艺出Drug Standards of China 2012,Vol.13 No.5中国药品标准2012年第13卷第5期333现强紫外吸收的原因。

1仪器与试药1.1仪器Agilent 6890N气相色谱仪,HP7694顶空自动进样器;Agilent HP-5气相色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)。1.2试药柴胡注射液(多家生产企业提供);丁醛、戊醛、己醛、糠醛、庚醛参考物质(北京市药品检验所提供,纯度大于98%);聚山梨酯80(湖南尔康制药有限公司);水为乐百事纯净水,其它试剂为分析纯。

2柴胡注射液试验对照样品的制备按照现行标准,柴胡注射液的制法是将柴胡药材切断后,加水蒸馏,蒸馏液再重蒸馏,然后再加入聚山梨酯80和氯化钠制备而成。但该工艺生产的产品很难达到其标准〔检查〕项下的紫外吸收要求。据调研,现在企业的生产工艺大多是加入盐酸和氯化钠进行蒸馏,所得蒸馏液紫外吸收很强,远远超出标准要求。为了阐明加酸、加盐工艺出现强紫外吸收的机理,我们按照现行标准的制备工艺和廉价柴胡注射液的生产工艺(加酸、加盐反复蒸馏)制备相应的样品。2.1自制柴胡注射液样品按照柴胡注射液现行标准的制法,取柴胡100 g,切断,加11倍量水,90℃温浸24 h,水蒸气蒸馏,收集初馏液500 ml,再重蒸馏,收集重馏液约100 ml,加入0.3 g聚山梨酯80,搅拌使油完全溶解,再加入0.9 g氯化钠,溶解后,滤过,加注射用水至100 mL,得样品A。2.2模拟加酸、加盐工艺制备柴胡注射液样品取柴胡100 g,切断,加11倍量水,加5.5 mL盐酸和55 g氯化钠,90℃温浸24 h,水蒸气蒸馏,收集初馏液500 mL,再重蒸馏,收集重馏液约100 mL,加入0.3 g聚山梨酯80,搅拌使油完全溶解,再加入0.9g氯化钠,溶解后,滤过,加注射用水至100 mL,得样品B1。再向烧瓶中加入500 mL水,蒸馏,收集蒸馏液500 mL,重蒸馏,收集重馏液约100 mL,加入0.3 g聚山梨酯80,搅拌使油完全溶解,再加入0.9 g氯化钠,溶解后,滤过,加注射用水至100 mL,得样品B2。如此再反复操作12遍,依次得到样品B3～B14。

3紫外吸收检查3.1紫外最大吸收波长的测定按照现行标准〔检查〕项下方法对部分企业生产样品、实验室自制的样品A以及样品B1进行紫外扫描,测定紫外光谱和最大吸收波长,各样品紫外光谱及其最大吸收波长见图1。图1不同生产工艺柴胡注射液的UV光谱图A.样品A;B.样品B13.2 278 nm波长条件下测定按照现行标准〔检查〕项下方法,在278 nm波长处对部分企业生产的样品及实验室自制样品进行测定,结果见表1。表1柴胡注射液在278 nm的紫外吸收测定结果样品批号吸收值样品编号吸收值厂家A 080901 1.09现行标准工艺自制A 0.39090103 1.15加酸加盐工艺自制B1 3.06厂家B 000007 0.71加酸加盐工艺自制B2 1.15000008 0.76加酸加盐工艺自制B3 1.37厂家C 1008221 0.16加酸加盐工艺自制B4 1.221008222 0.15加酸加盐工艺自制B5 1.42厂家D 20100206 0.91加酸加盐工艺自制B9 1.6420100404 1.03加酸加盐工艺自制B10 1.7720100405 1.05加酸加盐工艺自制B11 1.78厂家E 100629 0.76加酸加盐工艺自制B12 1.79100725 0.77加酸加盐工艺自制B13 1.66厂家F K-100801 0.08加酸加盐工艺自制B14 1.94K-100802 0.02

4柴胡注射液化学成分分析4.1柴胡注射液GC分析4.1.1色谱条件聚二甲基硅氧烷为固定相的石英毛细管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25μm,载气为N2,流量1.0 mL·min-1,恒流方式,分流比为20∶1;进样口温度230℃,FID检测器温度260℃;升中国药品标准2012年第13卷第5期334 Drug Standards of China 2012,Vol.13 No.5温程序初始为35℃,保持2 min,1℃·min-1升至40℃,保持2 min,3℃·min-1升至60℃,保持3min,7℃·min-1升至200℃,保持3 min。进样器为HP7694顶空自动进样器。顶空进样器条件为顶空瓶温度85℃,进样阀温度100℃,传输线温度115℃;顶空瓶平衡时间15 min,顶空瓶充压时间0.2 min,定量环填充时间0.2 min,定量环平衡时间0.5 min,进样时间1.0 min。4.1.2结果分析按照分析条件,对市场上的部分柴胡注射液和实验室制备的柴胡注射液进行分析,见图2。图2不同来源柴胡注射液的GC色谱图(从下到上依次为自制样品A,B1,B2,B7,B14及厂家A,B,C,D,E和F生产的柴胡注射液样品)从图2可以看出,按照现行标准制备的注射液的GC指纹图谱与加酸加盐制备的注射液的GC指纹图谱有明显的差别,加酸加盐后保留时间12.6min及23～29 min部分的高沸点成分的含量明显增加,而23 min之前的成分含量明显降低,色谱峰总面积也低于现行标准的工艺(表2)。市售的6批柴胡注射液可以看出检出的色谱峰很少,但4批样品中均检出了保留时间12.6 min的色谱峰,与经过反复加酸、加盐处理的样品相同。表2实验室制备样品的色谱峰总面积比较样品色谱峰总面积样品色谱峰总面积A 8 241.80 B8 520.28B1 6 623.37 B9 224.45B2 1 108.90 B10 323.00B3 622.08 B11 195.63B4 410.43 B12 152.20B5 408.35 B13 156.97B6 364.27 B14 172.01B7 311.924.2柴胡注射液的成分分析为了搞清加酸加盐后引起柴胡注射液成分的变化,我们首先对不同工艺的柴胡注射液进行了GC-MS分析(结果另文报道)。根据GC-MS的分析结果,进一步采用丁醛、戊醛、己醛、糠醛和庚醛参考物质为对照,以B1样品为例,对GC的部分色谱峰进行了指认,见图3。通过上述分析可以看出,柴胡注射液经加酸、加盐处理后,增加的保留时间为12.6min色谱峰为糠醛峰。图3 GC指纹图谱各主要色谱峰指认比较加酸加盐后再加水蒸馏出来的注射液的GC色谱图(图2,表2)可以看出,随着蒸馏次数的增加,其色谱峰总面积明显降低,第三次(B3)即降低到第一次的10%以下;第五次以后,各成分基本上都是微量。但糠醛的色谱峰一直存在,其含量没有明显的降低。另外,从UV 278 nm波长处吸光度测定结果可以看出,从B2→B14,吸光度并没有降低,反而有升高的趋势。因此,我们怀疑紫外278 nm波长处吸光度与糠醛有关,为此,对鉴定的五个醛类包括丁醛、戊醛、己醛、糠醛、庚醛的紫外图谱进行了测定。各溶液的浓度均为每1 mL含1 mg,其紫外光谱和吸光度见图4。结果表明,糠醛的紫外最大吸收正好在278 nm,且吸收很强,其他醛类的最大吸收也在278 nm附近,但吸收较弱。因此,可以初步断定,目前现行标准中检测的吸光度主要是注射液中醛类成分的贡献,而糠醛在其中发挥了重要的作用,即使第五次蒸馏以后,其他成分基本难以检出,但吸光度仍然高于现行标准中的规定。不加酸和盐的现行标准的工艺生产的注射液由于糠醛含量很低,反而达不到吸光度检查的要求。另外,市售的样品中,厂家C和厂家F生产的柴胡注射液其UV 278 nm下的吸光度不符合标准规定,经GC分析,发现这两个厂家生产的这几个批号的样品刚好也没有检测糠醛等色谱峰,这就进一步为现行标准中278 nm下测定的吸光度主要来源于糠醛等醛类化合物提供了证据。

5结果与讨论柴胡注射液质量标准的〔检查〕项下在278 nmDrug Standards of China 2012,Vol.13 No.5中国药品标准2012年第13卷第5期335图4各种醛类紫外扫描图谱测定的吸光度主要是糠醛等的贡献。糠醛属中等有毒物质,柴胡注射液中的糠醛主要由柴胡中的五碳糖加热脱水产生,尤其是在酸性条件下,更容易脱水。当柴胡药材加水后进行加热提取和蒸馏时,加入盐酸,一方面使提取液中的游离五碳糖脱水生成糠醛,另一方面,柴胡中的多糖在酸性条件下不断水解,不断产生单糖,单糖又脱水生成糠醛,因此,只要加入酸水蒸馏,就会不断有糠醛生成,其蒸馏液都会符合标准规定值。而按照现行标准生产的柴胡注射液由于糠醛含量极低,反而达不到标准规定值。虽然糠醛在烘烤的食品中也常出现,属于食品中允许存在的物质。但研究表明,在大剂量情况下,动物经呼吸道吸入糠醛后有麻醉作用、产生呼吸道刺激作用、肺水肿和肝脏损害,中枢神经系统损害,严重时导致死亡[3]。人吸入也会产生皮肤及粘膜刺激、头疼、呼吸困难、恶心、呕吐及肺水肿等毒副作用[4]。因此,糠醛必须得到严格控制。目前柴胡注射液的质量标准包括〔制法〕、〔性状〕、〔鉴别〕、〔检查〕等项目,除前述的吸光度检查存在问题外,其〔鉴别〕项下的两项鉴别方法也是针对醛类的鉴别,既缺乏专属性,也难以控制经过反复蒸馏而只含糠醛的注射液。柴胡注射液为常用中药注射剂,在临床发挥着重要作用。为了有效控制其质量,确保临床用药的安全有效,建议柴胡注射液质量标准中取消现有的鉴别和吸光度检查,建立专属性鉴别、糠醛的限量检查、指纹图谱和主要成分的多成分含量测定,提高注射液的质量标准。

作者：姜勇;鲍忠;石子仪;屠鹏飞